親和色譜基于生物分子固有的特異性相互作用進(jìn)行樣品的高選擇性分離。特異性相互作用包括醇能與底物、抑制物、輔酶等的結(jié)合；抗體與抗原的結(jié)合：凝集素與細(xì)胞表面抗原以及某些糖類(lèi)的結(jié)合等。

分離原理如圖所示：

將可以與目標(biāo)分離分子產(chǎn)生特異性相互作用的分子固定在固定相基質(zhì)上，復(fù)雜樣品基質(zhì)中的分子由于不存在這種特異性作用，因此與固定相的作用相對(duì)較弱，被率xian洗脫，目標(biāo)分子最后被洗脫。

依親和色譜固定相所帶配基與樣品之間相互作用可將其分為專(zhuān)用型和通用型兩類(lèi)。親和配基既可以與基質(zhì)直接偶聯(lián)，也可以通過(guò)間隔臂間接連接。

適當(dāng)?shù)拈g隔臂可以有效地克服基質(zhì)表面的位阻效應(yīng)，使得配體更容易與被分離物結(jié)合，帶有間隔臂的AFC固定相往往具有更為優(yōu)異的色譜性能。對(duì)以小分子為配體分離大分子的親和固定相來(lái)說(shuō)，間隔臂的作用顯得更為重要。AFC固定相的間隔臂按其結(jié)構(gòu)類(lèi)型,主要包括烴類(lèi)、鏈狀的聚胺類(lèi)、肽類(lèi)、鏈狀聚醚類(lèi)等。氨烷基化合物NH₂(CH₂)nR，R是常用的間隔臂，其中，R可為羧基、羥基、氨基或配位體自身。具有疏水性的間隔臂可能與配基或樣品間產(chǎn)生非特異相互作用,干擾親和分離。為消除非特異性吸附干擾,可在沿間隔臂分子的長(zhǎng)軸方向某些原子上偶聯(lián)亞氨基、羥基等官能團(tuán)，增加親水性。

親和色譜固定相上固定的配基包括染料配基、金屬離子配基、包合配合物配基、特異性民基、電荷轉(zhuǎn)移配基和共價(jià)配基。三嗪活性染料的結(jié)構(gòu)與生物酶的天然底物接近,可與酶活蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)結(jié)合應(yīng)用于親和色譜。Cu²⁺、Zn²、Ni²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺等金屬離子通過(guò)具有整合作用的有機(jī)官能團(tuán)固定在基質(zhì)或間隔臂上,利用螯合物中的金屬離子與生物分子間的特異性親和作用實(shí)現(xiàn)生物分子的分離或純化。常用的螯合劑包括亞氨基二乙酸、亞氨基二乙醛、肟、硫脲、吡啶咪唑、8-羥基喹啉等。

包合物配基由主體與客體分子間特殊親和作用力形成,主體化合物具有環(huán)狀知或穴,客體分子可以被包合在環(huán)內(nèi)或空穴內(nèi)形成包合物。常用的主體分子包括環(huán)糊精、杯芳烴等。

為了保持生物分子的活性,一般需要采用溫和的洗脫條件。親和色譜中通常采用具有不同pH的緩沖溶液作為流動(dòng)相，緩沖體系由無(wú)機(jī)或有機(jī)弱酸、弱堿與其鹽組成。為保持分子的活性：P值保持在6~8之間。滿足這一條件的沖體系較少，包括酸鹽、三基)氨基甲烷(Tris-HCI)、硼酸鹽等。磷酸鹽緩沖溶液緩沖容量較小，且容易與高價(jià)陽(yáng)離子生成沉淀，并在很多代謝體系中起到抑制劑的作用。Tris-HCl體系在pH<7.5時(shí)緩沖容量小有較強(qiáng)反應(yīng)活性,也同樣對(duì)很多代謝體系有抑制劑作用。硼酸鹽體系可與眾多生物有機(jī)物成配合物影響分離。甘氨酰甘氨酸在pH>8時(shí)緩沖能力ji強(qiáng),但pH=7.5以下幾乎沒(méi)有緩符作用。

由Good等計(jì)研發(fā)的Goods系列沖溶液包括12種緩沖溶液，具有緩沖能力強(qiáng)、低子強(qiáng)度等特征，可在pH=6.1~10.7范圍內(nèi)應(yīng)用于生物學(xué)和生理學(xué)研究。

通用型親和配基與溶質(zhì)之間作用力通常不強(qiáng),大多數(shù)情況下非選擇性流動(dòng)相即可完成不同組分的分離。當(dāng)生物分子與配基形成穩(wěn)定常數(shù)較小的配合物時(shí)，等度條件下，采用洗脫能力弱的、具有不同pH值的緩沖溶液即可使配合物解離實(shí)現(xiàn)洗脫。當(dāng)除了配位作用，還有靜電吸引力、氫鍵力或疏水相互作用等引起的非特異性相互作用存在時(shí)，可通過(guò)改變p出值離子強(qiáng)度、流動(dòng)相極性、加入離液序列試劑等消除其干擾。其中離液序列試劑可改變生物分子結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)變性從而破壞親和作用。采用低濃度離液序列試劑能夠在盡可能保持蛋自質(zhì)分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)快速洗脫。

專(zhuān)用型親和配基與目標(biāo)溶質(zhì)間親和作用較強(qiáng)，需要采用含有特定組分、具有chao強(qiáng)洗能力的流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。此時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入另一種游離配基以取代固定相上的配基與目標(biāo)化合物結(jié)合實(shí)現(xiàn)洗脫。此外，還可以通過(guò)選擇性斷裂固定相基質(zhì)與配基之間的化學(xué)鍵的方法實(shí)現(xiàn)洗脫。由于洗脫后目標(biāo)分子仍與配基相連，需采用適當(dāng)方法（如改變pH值或加入變性劑等）將其游離出來(lái)。

在親和色譜分析中，分離、純化的對(duì)象皆為氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核破、核苷、核苷酸、寡聚和多聚核苷酸、核糖核酸、脫氧核糖核酸以及酶、輔酶、寡糖、多糖等生物分子，其中大多數(shù)為極性化合物，不少還具有生物活性。因此，當(dāng)從固定相上將它們洗脫下來(lái)時(shí)需使用H值接近于中性的稀緩沖溶液，以在比較溫和的洗脫條件下，保持其生物活性。親和色譜分離進(jìn)行前，需先對(duì)固定相進(jìn)行平衡，平衡緩沖溶液的pH、離子強(qiáng)度、溫度和化學(xué)組成都應(yīng)使配基與溶質(zhì)之間產(chǎn)生較強(qiáng)的相互作用以利于保留。溫度是親和色譜分離的重要條件，親和作用強(qiáng)度通常隨溫度升高而減小，可利用不同的溫度吸附和脫附。配基與生物分子間相互作用達(dá)到平衡的過(guò)程緩慢,樣品應(yīng)以較慢速度加載,流動(dòng)相流速也不應(yīng)過(guò)快。對(duì)親和力較強(qiáng)的固定相，樣品體積的影響不大；親和力較弱時(shí)，樣品體積不宜過(guò)大。梯度洗脫時(shí)，可采用溫度梯度、pH梯度或離子強(qiáng)度梯度。