正相色譜是我們色譜分離中一種常用的分離模式。其分離原理是基于固定相的極性大于流動(dòng)相,通過(guò)吸附作用,實(shí)現(xiàn)不同極性物質(zhì)之間的分離。正相色譜的優(yōu)勢(shì)是可用于分離反相色譜不保留或極性較強(qiáng)的化合物,且適用于絕不溶于水的物質(zhì)分離。
但是正相色譜也有困擾我們的難題。經(jīng)常會(huì)有老師在使用正相色譜柱時(shí)出現(xiàn)出峰保留時(shí)間漂移的情況,有些是使用的正相柱子,樣品出峰不斷地有前移的趨勢(shì),有些是新買(mǎi)的正相柱子分離樣品保留時(shí)間和原有的舊柱子不一致等。
這到底是怎么回事呢,出現(xiàn)這類(lèi)保留時(shí)間漂移的問(wèn)題又該如何解決呢?今天小旭就帶大家一探究竟。
? 定義:
固定相的極性大于流動(dòng)相,基于固液吸附的原理,分離不同極性的樣品。
? 洗脫順序:
極性低的物質(zhì)先被洗脫出來(lái)。流動(dòng)相的極性越強(qiáng),洗脫能力也越強(qiáng)。
? 常見(jiàn)的正相色譜柱有:
硅膠柱,二醇基柱,氨基柱,氰基柱。
? 常用的流動(dòng)相:
主要試劑:烷烴(戊烷,己烷,庚烷,辛烷),芳香烴(苯,甲苯,二甲苯),二氯甲烷,四氯化碳。
輔助試劑:甲基-t-丁基醚(MTBE),yi醚,四氫呋喃(THF),乙酸乙酯,乙腈,丙酮等。
正相色譜的優(yōu)勢(shì)是可用于分離反相色譜中不保留或極性較強(qiáng)的化合物,且適用于絕不溶于水的物質(zhì)分離,還可用于拆分異構(gòu)體。但正相色譜中,卻易出現(xiàn)保留時(shí)間漂移的情況。這究竟是什么原因呢?
原來(lái)正相色譜柱的固定相,特別是硅膠柱中未改性的裸硅膠,其中的硅醇基的極性特別強(qiáng),其對(duì)流動(dòng)相中甚至是實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的水分含量非常敏感。而由于正相色譜中固定相的水分含量常常是個(gè)影響選擇性的關(guān)鍵參數(shù),流動(dòng)相中的水分含量通常影響保留時(shí)間和分離度。我們知道大部分溶劑都含有小部分的溶解水,比如正己烷在20℃下,其水分含量是0.0111%w/w。因此正相色譜中出現(xiàn)保留時(shí)間波動(dòng)較大的問(wèn)題,大多可歸因于固定相或流動(dòng)相中水分含量的變化,而填料可能還是完好的。
那么正相色譜中,出現(xiàn)這種固定相或者流動(dòng)相中的水分含量影響物質(zhì)保留時(shí)間的問(wèn)題,該如何解決呢?
小旭給大家分享兩個(gè)解決方法:
1、去除固定相上的水分
用含2.5%二甲氧基丙烷(dimethoxypropane)和2.5%冰醋酸的正己烷沖洗色譜柱30個(gè)柱體積;
2、使用水分含量可控的流動(dòng)相(比如:用水半飽和)
半飽和流動(dòng)相配置方式:將無(wú)水的非極性流動(dòng)相分成兩半;其中一半中加入一定量水,并混勻攪拌約一小時(shí),靜置分層后,將多余的水相全部除去;將兩部分非極性流動(dòng)相重新混合在一起就配成了“半飽和"流動(dòng)相。
? 售后案例背景
客戶(hù)新買(mǎi)的Topsil®(拓譜)Silica硅膠柱,在做一個(gè)老項(xiàng)目時(shí),目標(biāo)化合物的保留時(shí)間出現(xiàn)了漂移。同時(shí)對(duì)比舊柱子上目標(biāo)化合物的保留時(shí)間是在10min左右,而新柱子的目標(biāo)化合物的保留時(shí)間卻出現(xiàn)在了20min左右。
色譜條件:
色譜柱:月旭Topsil® Silica(4.6×250mm,5μm)。
流動(dòng)相:乙酸乙酯/正己烷/甲醇/正丙醇=60/40/2/1;
檢測(cè)波長(zhǎng):256nm;
柱溫:30℃;
流速:1.0mL/min;
進(jìn)樣量:100μL。
? 售后排查
月旭實(shí)驗(yàn)室對(duì)該項(xiàng)目進(jìn)行了驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)的確在新柱子上目標(biāo)化合物的保留時(shí)間與客戶(hù)實(shí)驗(yàn)室的做樣結(jié)果一致,在20min左右。
繼而月旭實(shí)驗(yàn)室對(duì)該方法流動(dòng)相中的主要試劑乙酸乙酯和正己烷進(jìn)行了水半飽和的操作,使用水半飽和的流動(dòng)相重復(fù)了實(shí)驗(yàn),樣品中目標(biāo)物的保留時(shí)間穩(wěn)定在了14min左右,與客戶(hù)實(shí)驗(yàn)室用舊柱子做樣的保留時(shí)間基本一致。如下圖。
通過(guò)月旭實(shí)驗(yàn)室的排查驗(yàn)證,流動(dòng)相用水半飽和的方法,wan美解決了客戶(hù)在應(yīng)用正相色譜柱時(shí)出現(xiàn)目標(biāo)峰保留時(shí)間漂移的問(wèn)題。
我們回訪(fǎng)客戶(hù)后,還有彩蛋哦~
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