小伙伴們?cè)谧鋈粘z測(cè)，會(huì)發(fā)現(xiàn)有些項(xiàng)目，測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)上使用的流動(dòng)相中加入了像庚烷磺酸鈉、四丁基氫氧化銨、四丁基溴化銨等試劑，這類試劑我們稱為離子對(duì)試劑，它可以用來改善分離和峰形、縮窄樣品的保留范圍等。離子對(duì)試劑可以看成是在高效液相色譜法中引入了離子色譜方法的一種表現(xiàn)。今天小編和小伙伴們聊聊離子對(duì)色譜法的保留基本原理和一些特殊問題。
離子對(duì)色譜法（IPC）可被看做是以分離離子樣品為目標(biāo)的反相色譜法的改良形式。IPC和RPCwei一不同的條件是IPC在流動(dòng)相中添加了離子對(duì)試劑R+或R-，這些試劑能在平衡過程中，與酸性化合物的A-或堿性化合物的BH+發(fā)生相互作用：
離子化溶質(zhì) 離子對(duì)
（酸）A-+R+ ? A-R+
（堿）BH++R- ? BH+R-
親水性溶質(zhì) 疏水性離子對(duì)
（在RPC保留較少） （在RPC保留較多）
使用IPC可令樣品的保留行為產(chǎn)生類似于改變流動(dòng)相pH的變化，但是IPC能更好地控制酸性溶質(zhì)或堿性溶質(zhì)的保留行為，而且無需使用ji端的pH（如pH<2.5或pH>8）。典型的離子對(duì)試劑包括烷基磺酸鹽R-SO3-(R-)和四烷基銨鹽R4N+(R+)，以及強(qiáng)羧酸（通常是離子化的）（四氟yi酸、TFA；七氟丁酸酐、HFBA（R-）），還有所謂的離液劑（BF4-、ClO4-、PF6-）。
有關(guān)IPC的保留機(jī)理目前有兩種說法。
一種說法是離子對(duì)在溶液中形成，然后被保留在色譜柱上，溶質(zhì)保留平衡過程如下（以離子化的酸性溶質(zhì)A-和四烷基銨鹽R+形成離子對(duì)為例）：
A-R+（流動(dòng)相） ? A-R+（固定相）
根據(jù)這個(gè)說法，溶質(zhì)保留由以下因素決定：
① 溶質(zhì)分子A在流動(dòng)相中已電離的部分（取決于流動(dòng)相pH和溶質(zhì)的pKa）；
② IPC試劑的濃度和它形成離子對(duì)的趨勢(shì)；
③ 離子對(duì)復(fù)合物A-R+的k值。
另一種說法則認(rèn)為，IPC試劑先被固定相保留，然后溶質(zhì)的保留是離子交換的過程，例如，離子化的酸性流動(dòng)相A-和IPC試劑R+X-：
A-（流動(dòng)相）+ R+X-（固定相）
?
A-R+（固定相）+ X-（流動(dòng)相）
即是，離子對(duì)試劑 R+X-先吸附到固定相上，然后樣品離子A-代替固定相上的反離子X-。這兩種IPC的保留過程都可能在任一個(gè)給定的分離中占優(yōu)勢(shì)，但是哪一種機(jī)制起著更為重要的作用既不容易確定，對(duì)實(shí)際操作也不重要。
在IPC中，可以用于控制選擇性的分離條件包括：
? pH；
? IPC試劑的類型（磺酸鹽、季銨鹽、離液劑）；
? IPC試劑的濃度；
? 溶劑強(qiáng)度（B%）；
? 溶劑類型（甲醇、乙腈等）；
? 溫度；
? 色譜柱類型；
? 緩沖溶液的類型和濃度。
無機(jī)試劑（或“離液劑"）如ClO4-、BF4-和PF6-可用于代替常用的烷基磺酸鹽作為IPC試劑。無機(jī)試劑在固定相上的保留較少，它的保留機(jī)理更接近上述的第一種說法，在流動(dòng)相中形成離子對(duì)。離液劑能更好地用于梯度洗脫（有較小的基線噪音和漂移），且當(dāng)B%較高時(shí)也能較好的溶解在流動(dòng)相中。
但是使用離子對(duì)試劑也有一些特殊問題，在某些情況下需要嚴(yán)格控制流動(dòng)相pH；溫度控制的重現(xiàn)性必須較高（比RPC更需要），此外，IPC中的某些問題不會(huì)在RPC分離中出現(xiàn)或與其他RPC有所不同。還有就是出現(xiàn)偽峰、改變流動(dòng)相周柱平衡緩慢、有不明原因造成的糟糕的色譜峰型等。
首先是偽峰。當(dāng)把樣品溶劑（不含樣品）注入到IPC中（即空白實(shí)驗(yàn)），我們有時(shí)會(huì)觀察到正峰和負(fù)峰同時(shí)出現(xiàn)的情況。導(dǎo)致偽峰的原因通常是由流動(dòng)相和樣品溶劑的組成之間存在差異引起的。而使用不純的IPC試劑、緩沖液或其他的流動(dòng)相添加劑都會(huì)使偽峰的問題更為嚴(yán)重。
其次是緩慢的柱平衡。當(dāng)使用新的流動(dòng)相時(shí)，必須用足夠體積的流動(dòng)相沖洗色譜柱以使色譜柱達(dá)到平衡。在IPC中，IPC試劑在色譜柱上的吸附和解吸附在某些情況下非常緩慢，這會(huì)造成色譜柱不能被新的流動(dòng)相*平衡。所以，無論是舊的流動(dòng)相還是新的流動(dòng)相含有IPC試劑時(shí)，我們必須確定改變流動(dòng)相后樣品的保留具有重現(xiàn)性（需要以新的流動(dòng)相進(jìn)行幾小時(shí)的沖洗色譜柱才能達(dá)到*平衡）。更換IPC試劑時(shí)，先用特殊的洗脫劑把先前吸附在色譜柱上的IPC試劑洗脫下來，再用新的流動(dòng)相對(duì)色譜柱進(jìn)行平衡。
陰離子試劑（如烷基磺酸鹽）能用組成為50%~80%甲醇-水的洗脫劑洗脫下來；季銨鹽需要使用50%甲醇-緩沖液（如，pH為4~5的100mmol/L的磷酸氫二鉀溶液，加入磷酸氫二鉀是為了減少季銨基團(tuán)與固定相上離子化的硅醇基間的相互作用）。任一情況下，首先應(yīng)使用至少等于20倍柱體積的洗脫劑來沖洗色譜柱，然后再使用新的流動(dòng)相進(jìn)行柱平衡。另外，像較弱的離子對(duì)緩沖液三氟yi酸（TFA）以及離液劑，不會(huì)減緩柱平衡的過程，通常用10~20倍的含TFA或離液劑的流動(dòng)相沖洗色譜柱足以達(dá)到柱平衡。
用含IPC試劑的流動(dòng)相進(jìn)行色譜柱的初始平衡，則平衡過程可能會(huì)非常緩慢。為了避免在開展常規(guī)實(shí)驗(yàn)的每個(gè)新系列之前都要進(jìn)行12h的平衡，我們建議在完成每個(gè)系列的實(shí)驗(yàn)后把色譜柱浸泡在流動(dòng)相（含IPC試劑）里儲(chǔ)存。這個(gè)權(quán)宜的方法使得以IPC做含量測(cè)定時(shí)能更快的達(dá)到柱平衡；假如需要每天或每兩天重復(fù)一次，我們也建議使用這個(gè)辦法，然而，當(dāng)以這種方式儲(chǔ)存時(shí)，其使用壽命可能會(huì)縮短。
由于IPC試劑與色譜柱的緩慢的平衡過程，即使用較劇烈的洗脫程序，也不可能把IPC試劑*從色譜柱上洗脫下來?；谶@個(gè)原因，我們建議已用IPC分離的色譜柱不要再用于開展不含IPC試劑的RPC分離（TFA和離液劑例外）。
假如在IPC中觀察到糟糕的峰型和（或）柱塔板數(shù)的N值較低時(shí)，可以考慮改變柱溫。
以上就是離子對(duì)色譜法的保留原理，和一些特殊問題的解決方法，希望對(duì)小伙伴們以后用離子對(duì)色譜法能有所幫助。
