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His標(biāo)簽與IMAC配基

更新時間:2022-01-21 點擊次數(shù):1264

IMAC重要的應(yīng)用是純化His標(biāo)記重組蛋白,融合表達的His標(biāo)簽為含有6個或更多組氨酸殘基的片段。His標(biāo)簽具有相當(dāng)高的親和力和特異性,因此在大多數(shù)情況下,IMAC一步純化足以制備一定純度的目標(biāo)蛋白質(zhì),且可滿足很多應(yīng)用的要求。

標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)(即位置、順序和長度)可以從多個水平影響蛋白質(zhì)生產(chǎn):表達率、與IMAC配基的結(jié)合能力、蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)晶體的形成等,而且其雖然對溶解度和活性影響輕微,但也有一定作用。

His標(biāo)簽常見的形式是由6個連續(xù)的組氨酸殘基組成,可以提供6個金屬結(jié)合位點。大多數(shù)情況下,結(jié)合/解離平衡轉(zhuǎn)換能力越高,使平衡傾向于結(jié)合的方向,越可能具有穩(wěn)定的結(jié)合能力。Biacore檢測結(jié)果顯示,在pH7.0-7.4時,六聚組氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)與Ni-NTA的解離速率為1×106-1.4×108。然而,平面芯片表面的流動性、配體密度和蛋白質(zhì)濃度與多孔隙瓊脂糖顆粒非常不同。此外,His標(biāo)記蛋白質(zhì)與IMAC配基相互作用的穩(wěn)定性受標(biāo)簽的可接近程度和蛋白質(zhì)表面全部螯合殘基(組氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)數(shù)量的影響,因此在很大程度上這種相互作用是獨立的。也就是說,通常即使在苛刻的條件下,如果His標(biāo)簽是易接近的(大多數(shù)情況下均是如此),那么對于柱層析,蛋白質(zhì)與Ni-NTA的親和力也是足夠高的。

IMACzui常用的配體是亞氨基二乙酸(IDA)和次氨基三乙酸(NTA),與Cu2+、Ni2+、Zn2+等金屬離子配位時,前者有3個配位基團,后者有4個配位基團。Cu2+、Ni2+、Zn2+這些離子在水溶液中以六配位體化合物的形式存在。螯合配體的配位基團多,與金屬螯合牢,但金屬可供蛋白質(zhì)配位的位點少,與蛋白質(zhì)結(jié)合力減弱。因此,一般IDA與蛋白質(zhì)的結(jié)合比NTA強;但是NTA與金屬螯合牢,金屬離子不容易脫落。

 

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